原核表明操作步骤及注意事项

日期:2019-10-04编辑作者:明星

今天的课程进入了选修,开始接触高大上的基因工程,细胞工程了。老实说,我上大学的时候,也只是选修,还无缘接触这些高大上的实验。

核心提示: 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、 将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点:易于生长和控制;用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是,在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 表达载体在基因工程中具有十分重要的作用,原核表达载体通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件: 选择标志的编码序列; 可控转录的启动子; 转录调控序列; 一个多限制酶切位点接头; 宿主体内自主复制的序列。 原核表达一般程序如下: 获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测 一、试剂准备 1、LB培养基。 2、100mMIPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38gIPTG溶于100mlddH2O中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。 二、操作步骤 获得目的基因 1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。 构建重组表达载体 1、载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。 获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。 诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2mlLB(含Amp50μg/ml)中37℃过夜培养。 2、按1∶50比例稀释过夜菌,一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中,37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0(最好0.6,大约需3hr)。 3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。 4、分别取菌体1ml,离心12000g×30s收获沉淀,用100μl1%SDS重悬,混匀,70℃10min。 5、离心12000g×1min,取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。 三、注意事项 1、选择表达载体时,要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化,可选择融合表达;如为获得天然蛋白,可选择非融合表达。 2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时,对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。

彩世界首页,所以,这是真正的纸上谈兵。没想到,一个爆炸新闻,让课程生动和丰满起来。2017年国家最高科技奖花落中国工程院俩院士手中。

其中一个是研究火药的科学家,还真的是很爆炸的新闻。还有一个就是今天我要讲的我国第一个研制出基因工程药物和第一个成立基因药物公司的年近九旬的侯云德院士。

先从五百万奖金说起,果然成功引起学生的艳羡了。而后介绍侯院士超级牛的历史。早在早期留学苏联期间,他就发现实验室老鼠是因为感染了一种仙台病毒死亡,并发现了仙台病毒可以诱导动物细胞融合,为细胞工程中单克隆抗体的制备打下坚实基础。由于他的出色表现,他得以提前获得博士学位。并回来报效祖国,学生们露出了敬佩的神情。

他被人们称为干扰素之父,干扰素是抗病毒的一种淋巴因子,是由人类的淋巴细胞分泌的。可是国外研制的干扰素当时高达300元一支。

侯院士受到一些科学研究的启发,决定将人的干扰素基因试着导入容易繁殖的细菌体内,让细菌替人类生产干扰素。而后,他成功了,每支干扰素由进口的300元变成了30元。啊!学生们简直佩服的五体投地!不仅如此,侯院士还为我国病毒防治做出了积极的贡献,成为国家疾病防控的掌舵人。

那么,问题来了,干扰素这种蛋白质应该如何生产了,把人的干扰素基因导入细菌,有什么创新呢?

学生想到了跨越物种界限,突破了生殖隔离,很好!

第二,基因如何控制蛋白质合成呢?中心法则,对了!异种生物的基因缘何可以在另一个生物体内表达呢?原来它们共用一套遗传密码呀!

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